Der Experimentator: Proteinbiochemie/Proteomics by Hubert Rehm, Thomas Letzel

By Hubert Rehm, Thomas Letzel

Die überarbeitete und aktualisierte 7. Auflage dieses Buches gibt einen Überblick über bewährte und neue Methoden der Proteinbiochemie und Proteomics. Es zeigt Auswege aus experimentellen und strategischen Sackgassen. Zudem weckt es ein Gespür für das richtige scan zur richtigen Zeit. Behandelt werden klassische Verfahren wie Säulenchromatographie, HPLC, Elektrophoresen, Blots, ELISA, Ligandenbindungstests, die Herstellung von Antikörpern, das Solubilisieren von Membranproteinen, die examine von Glykoproteinen usw. Einen großen Raum nehmen die modernen Verfahren ein: Massenspektrometrie, Proteomics und thermische examine. In die 7. Auflage wurden neue Techniken zur Bestimmung der Wechselwirkung von Proteinen mit Proteinen oder von Proteinen mit kleinen Molekülen aufgenommen: DARTS, DRACALA, SPROX und andere. Des weiteren erfahren Sie, wie guy mit dem Massenspektrometer eine Bindung misst. Auch Methoden zur Herstellung von Bindungsproteinen gegen bestimmte Zielmoleküle werden vorgestellt: Ribosomen reveal und DNA- und Peptid-Aptamer-Techniken. Der Fluoreszenznachweis von Proteinen mit Hilfe von Trihalogenverbindungen durfte nicht fehlen und wer die Stabilität und Faltung von Proteinen messen will, kann hier nachlesen, ob er dazu ein CD-Spektrometer benutzen sollte. Auf die Fortschritte in der HPLC und der Massenspektrometrie von Membranproteinen wird ebenso eingegangen wie auf ihre Rekonstitution in Nanoscheibchen (Nanodiscs). Die Mikrodissektion mit UV-Laser, die isoelektrische Fokussierung in Kapillaren und iTRAQ-Tags werden erklärt. Dazu kommt eine Anzahl neuer tips zur Proteinbestimmung, Gelfärbung, Blottechnik, Immunfärbung, Elution aus Gelstückchen etc.

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Sie eignen sich für Proteinfärbung, Immunfärbung, Lektinfärbung, 45 Ca2+-Färbung und für Aminosäuresequenzierungen und -analysen (Gültekin und Heermann 1988). Für Blot und Entwicklung gelten ähnliche Bedingungen wie bei Nitrocellulose, doch bindet die PVDF-Membran im Gegensatz zu Nitrocellulose auch kleine Mengen von Protein nicht vollständig: Je nach Protein passieren 10–50 %. Wässrige Lösungen benetzen trockene PVDF-Membranen nicht; sie müssen zuvor in Methanol quellen. Feuchte PVDFMembranen sind lichtdurchlässig und in DioxanIsobutanol durchsichtig, gefärbte Banden können also im Scanner gemessen werden.

Geisterbanden haben also nur insofern etwas mit spiritistischen Erscheinungen zu tun, als sie beide vom Kopf verursacht werden: Die einen entstehen darauf, die anderen darin. Nach Yokota schwimmen die Keratine nicht nur in der Probe, sie sitzen auch und vor allem in den Probetaschen des SDS-Gels. Geisterbanden erhalten Sie nämlich schon, wenn Sie das Gel ohne Probe laufen lassen. Waschen der Taschen mit Wasser nützt wenig, waschen mit Probenpuffer vergrößert das Problem – vermutlich, weil der Probenpuffer die Keratine ins Gel diffundieren lässt.

Bei nativen Gelelek- trophoresen, übersteht die Aktivität eines Enzyms die Elektrophorese-Tortur. Sie können dann versuchen, die Enzymbande im Gel selektiv über die Enzymaktivität anzufärben. Gut eignen sich dazu Proteasen oder Enzyme, die Phosphat oder CO2 freisetzen (Lynn und Clevette-Radford 1981; Nimmo und Nimmo 1982). 3 Trocknen Sauber getrocknete und abgeheftete Gele zieren das Protokollbuch und sind ein handfester Beweis Ihres Fleißes. Sie können zudem jederzeit prüfen, ob dies oder jenes Ergebnis wirklich so eindeutig war, wie sie glaubten, können ein zweites Foto schießen oder Banden ausschneiden und weiterverarbeiten.

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